潔凈室質量控制及其檢測方面的討論

潔凈室對于制藥工業的重要意義已為人們肯定。生物制品 是制 藥工業的一部分，對生產廠房有很高的潔凈要求^［1，2］。Gilland等曾在市售的 嗜酸乳桿菌產品中，分離到人為污染的短乳桿菌、發酵乳桿菌和植物乳桿菌等^［3］ 。生(sheng)物制(zhi)品(pin)生(sheng)產中，尤其是活(huo)菌、活(huo)疫苗的(de)(de)生(sheng)產中，經常(chang)受到(dao)不同程度的(de)(de)污(wu)染，因此，不僅 需要重(zhong)視潔凈(jing)室的(de)(de)建立(li)，更要重(zhong)視質量(liang)控制(zhi)方法及標準。

　　朝鮮戰爭中，美國(guo)發現大量(liang)(liang)電(dian)子儀器失靈，zui后找到(dao)了(le)(le)(le)(le)主要(yao)原因，是灰塵在作怪(guai)，促(cu)成了(le)(le)(le)(le)潔(jie) 凈(jing)技(ji)術(shu)的(de)(de)(de)(de)起步。1961年(nian)，誕生了(le)(le)(le)(le)世界(jie)上zui早(zao)的(de)(de)(de)(de)潔(jie)凈(jing)室(shi)標準，既美國(guo)*技(ji)術(shu)條令203，1963 年(nian)，頒布了(le)(le)(le)(le)上zui的(de)(de)(de)(de)潔(jie)凈(jing)室(shi)標準：美國(guo)聯邦FS209。1966年(nian)，頒布了(le)(le)(le)(le)修訂(ding)后的(de)(de)(de)(de)209A， 時至1992年(nian)，建立了(le)(le)(le)(le)迄今被廣泛采用的(de)(de)(de)(de)209E。上為了(le)(le)(le)(le)加強藥(yao)品、生物制品質量(liang)(liang)管理規范 （GMP），把潔(jie)凈(jing)室(shi)定(ding)為*的(de)(de)(de)(de)生產硬件之一(yi)。GMP對廠(chang)房、設備(bei)等，明(ming)確規定(ding)了(le)(le)(le)(le)相應的(de)(de)(de)(de)潔(jie)凈(jing)要(yao) 求(qiu)，并制訂(ding)了(le)(le)(le)(le)有關標準。

　　1　潔凈室的污染源

　　潔凈室污染源按性質可分物理、化學、生物等。直徑在0.001-1000μm的固態、液態或二者 的混合物質，包括生物粒子和非生物粒子，我們稱為懸浮粒子（airborne particles）。微生 物一般以無生命的粒子作載體而懸浮，以氣溶膠（Aerosol）形式存在于空氣中，1μm以下 者永外懸浮，10μm以上者會逐漸沉下來而形成菌塵。潔凈室污染可分為外部污染和內部污 染。外部污染指大氣塵污染，可以通過光電法測得。內部污染，是由人和有關的物品、設備 等引起的。人是潔凈室zui大的污染源，占90%左右。人和環境造成了潔凈室的污染，所以在 潔凈室中，人的數量和活動應有特別嚴格的限制。一般男性每人每分鐘向周圍排放1000個以 上的含菌粒子，女性為750個以上。穿衣服時，靜止態發菌量為10-300個/min·人，行走時 的發菌量為900-2500個/min·人。咳嗽一次發菌量為70-700個/min·人，噴嚏一次為400-60 0個/min·人^［4，5］。

　　2　潔凈室質控標準

表1　世(shi)界主要國家潔(jie)凈(jing)(jing)室標(biao)準(zhun)（潔(jie)凈(jing)(jing)度級別）

　　 潔(jie)(jie)凈(jing)(jing)(jing)室(shi)是(shi)指空氣潔(jie)(jie)凈(jing)(jing)(jing)度達到(dao)規定(ding)級(ji)別要求的(de)可供人(ren)類工作的(de)場所 ，其功能是(shi)控制(zhi)微粒的(de)污(wu)染(ran)(ran) 。一般(ban)按用途可分為(wei)：1.工業(ye)潔(jie)(jie)凈(jing)(jing)(jing)室(shi)，以無生命的(de)微粒為(wei)控制(zhi)對象；2.生物潔(jie)(jie)凈(jing)(jing)(jing)室(shi)，主(zhu)要 控制(zhi)微生物對工作對象的(de)污(wu)染(ran)(ran)。

　　世界主要國家的潔凈室標準見表1^［6，7］。美(mei)國(guo)是世界上(shang)zui早(zao)頒布(bu)潔凈室標(biao)準的(de) 國(guo)家，各(ge)國(guo)的(de)潔凈室標(biao)準都是在美(mei)國(guo)標(biao)準的(de)基礎上(shang)，結合各(ge)國(guo)的(de)實際情況而制(zhi)訂的(de)，我國(guo)的(de) 標(biao)準基本上(shang)參(can)照美(mei)國(guo)聯邦標(biao)準和歐共體的(de)標(biao)準而制(zhi)訂的(de)。

　　3　潔凈室質控的檢測方法及討論^［8］

　　3.1　塵埃粒子　由(you)于空(kong)氣(qi)中(zhong)存在大量塵(chen)埃(ai)粒(li)子(zi)，而微生(sheng)物(wu)大多(duo)(duo)依(yi)附于這些塵(chen)埃(ai)粒(li)子(zi)隨(sui)空(kong)氣(qi)流(liu)動造成污(wu)染。制 藥工業用多(duo)(duo)種方法獲得無菌(jun)狀態，過濾(lv)法以(yi)(yi)其捕(bu)集率(lv)高(gao)(gao)，又經(jing)濟而被(bei)廣泛使用。其中(zhong)，特別(bie) 應(ying)該提到(dao)的是采(cai)用了HEPA（High Eicienoy Particulate Air）過濾(lv)器，對0.3μm以(yi)(yi)上(shang)空(kong)氣(qi) 粒(li)子(zi)捕(bu)集率(lv)高(gao)(gao)達99.97%以(yi)(yi)上(shang)，除(chu)濾(lv)過病毒外，空(kong)氣(qi)中(zhong)所有微生(sheng)物(wu)顆粒(li)可(ke)被(bei)濾(lv)除(chu)。因(yin)此， 正常潔凈室是無菌(jun)的，但是，由(you)于人、物(wu)、環境等污(wu)染因(yin)素，潔凈室往(wang)往(wang)受到(dao)不同程度 污(wu)染。因(yin)此，我們多(duo)(duo)采(cai)用激(ji)光塵(chen)埃(ai)粒(li)子(zi)計數且進行監控。標(biao)準見表2。

表2　國內外有關懸浮粒子的測定標準（塵粒數/m³）

　　3.2　空氣微生物　空(kong)(kong)氣(qi)(qi)中(zhong)活(huo)(huo)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)大(da)多依附(fu)塵(chen)埃粒(li)子而(er)形成生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)活(huo)(huo)性粒(li)子。應用細菌(jun)采(cai)(cai)樣(yang)(yang)器(qi)(qi)(qi)抽取一(yi)(yi)定(ding)(ding)量的空(kong)(kong)氣(qi)(qi) 使(shi)其滯(zhi)留(liu)在培(pei)養(yang)基(ji)上，經過培(pei)養(yang)計數菌(jun)落數。早在現(xian)代微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)問世(shi)之前，人們就認為(wei)某(mou)些(xie)疾 病是(shi)由被稱為(wei)“瘴氣(qi)(qi)”的空(kong)(kong)氣(qi)(qi)污染而(er)引起。20世(shi)紀30年(nian)代，英國研(yan)(yan)制porton液體(ti)采(cai)(cai)樣(yang)(yang)器(qi)(qi)(qi)，美(mei) 國研(yan)(yan)制了(le)AGI液體(ti)采(cai)(cai)樣(yang)(yang)器(qi)(qi)(qi)。1941年(nian)，Bourdion使(shi)用裂縫式采(cai)(cai)樣(yang)(yang)器(qi)(qi)(qi)，成為(wei)空(kong)(kong)氣(qi)(qi)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)采(cai)(cai)樣(yang)(yang)測定(ding)(ding) 的開端。1956年(nian)，報道(dao)了(le)*個篩孔(kong)撞擊(ji)式采(cai)(cai)樣(yang)(yang)器(qi)(qi)(qi)，1958年(nian)A.A.Andersn對其加以改進并 定(ding)(ding)型生(sheng)(sheng)(sheng)產，稱為(wei)安德森(sen)（Anderson）空(kong)(kong)氣(qi)(qi)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)采(cai)(cai)樣(yang)(yang)器(qi)(qi)(qi)。它由頂罩、6節篩板、3個彈簧及抽氣(qi)(qi) 孔(kong)和動力裝置(zhi)構成。目前，這種采(cai)(cai)樣(yang)(yang)器(qi)(qi)(qi)已發展到8級，并有許多改進型。由于它采(cai)(cai)集粒(li)譜廣(guang) 、效率高、生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)失活(huo)(huo)率低等原(yuan)因而(er)廣(guang)泛使(shi)用至今。空(kong)(kong)氣(qi)(qi)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)采(cai)(cai)樣(yang)(yang)器(qi)(qi)(qi)一(yi)(yi)般分(fen)為(wei)七大(da)類：液體(ti) 式、固(gu)體(ti)式、沉降式、離心式、光散射(she)式和大(da)容量式。本文(wen)將對離心式空(kong)(kong)氣(qi)(qi)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)采(cai)(cai)樣(yang)(yang)器(qi)(qi)(qi)（R CS）作詳細討論(lun)。空(kong)(kong)氣(qi)(qi)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)測試標準見(jian)表3。

表3　國內外有關空氣微生物的測定標準（CFU/m³）

　　 3.3　表面微生物　為了(le)檢測(ce)潔凈室中墻(qiang)壁、地(di)板(ban)、儀(yi)器表面、桌 面、門(men)把等(deng)帶(dai)菌情況，通常選用接觸壓(ya)印(yin)法(fa)(fa)（Cortact）和棉拭法(fa)(fa)（Swabbing）等(deng)方法(fa)(fa)。需要(yao)時 ，還(huan)可與過濾裝置相結(jie)合來完成棉拭采(cai)樣。1941年，Walter和Hvcker報道了(le)COntact瓊(qiong)脂平 板(ban)方法(fa)(fa)，以后，Angelotti和Fotert等(deng)作了(le)進一(yi)步的工(gong)作。帶(dai)菌狀況都有要(yao)求，歐共體GMP（ 草案）規定，100級：平均(jun)菌落數不(bu)可超過5 個(ge)；1000級：25個(ge)；100000級：50個(ge)。表面微(wei)生(sheng)物的檢測(ce)，越來越受到(dao)人們(men)的重(zhong)視(shi)。

　　3.4　關于沉降平皿（Settle plate）　1881年Kock創立(li)。依(yi)靠空(kong)氣中的(de)(de)粒子(zi)自(zi)然(ran)沉降(jiang)(jiang)于瓊脂(zhi)平(ping)板上(shang)的(de)(de)這種(zhong)采(cai)(cai)集方法，由于粒子(zi)沉降(jiang)(jiang) 的(de)(de)速率很慢，如需采(cai)(cai)集到有(you)(you)效數量(liang)的(de)(de)粒子(zi)，就需暴(bao)露很長時(shi)間。但(dan)因空(kong)氣中的(de)(de)致病菌數量(liang)是 很少的(de)(de)，金黃色菌菌球(qiu)菌在醫院(yuan)病房空(kong)氣中平(ping)均每(mei)140升才有(you)(you)一(yi)(yi)個活菌粒子(zi)，為了彌補這個 缺陷，曾(ceng)采(cai)(cai)用直徑為14公分的(de)(de)大平(ping)皿，以增加瓊脂(zhi)的(de)(de)暴(bao)露面積。Harding和Williams還曾(ceng)用 一(yi)(yi)種(zhong)多層平(ping)板的(de)(de)方法來進一(yi)(yi)步暴(bao)露面積，每(mei)層放一(yi)(yi)個14公分直徑的(de)(de)平(ping)板，但(dan)結果(guo)不堪滿(man)意。

　　奧姆梁斯基曾試圖把采樣后平板上長出的菌落換算成一定體積空氣中的微生物含量，以便能 利用沉降平板法的采樣結果來測定空氣中的活菌濃度。為此，他設定了在100cm²營養瓊脂 上暴露5分鐘(zhong)后，培養長出(chu)的(de)(de)(de)菌(jun)(jun)(jun)(jun)落，即相當于10升空氣(qi)(qi)中(zhong)的(de)(de)(de)活菌(jun)(jun)(jun)(jun)數。由(you)于懸(xuan)浮(fu)在(zai)空氣(qi)(qi)中(zhong)的(de)(de)(de)含 菌(jun)(jun)(jun)(jun)粒(li)(li)子直(zhi)徑(jing)不(bu)超過100μm，這(zhe)些小(xiao)粒(li)(li)子在(zai)空氣(qi)(qi)中(zhong)的(de)(de)(de)沉(chen)(chen)降(jiang)(jiang)受空氣(qi)(qi)阻(zu)力的(de)(de)(de)影響，其沉(chen)(chen)降(jiang)(jiang)速率遵(zun)循 上的(de)(de)(de)Stokes公(gong)式(shi)。根(gen)據(ju)這(zhe)個(ge)公(gong)式(shi)，粒(li)(li)子的(de)(de)(de)沉(chen)(chen)降(jiang)(jiang)速率與其大(da)小(xiao)成(cheng)正比，但是，奧姆梁斯基 恰好(hao)忽略(lve)了這(zhe)一(yi)點，因此，它是不(bu)能成(cheng)立的(de)(de)(de)。例如，直(zhi)徑(jing)1μm的(de)(de)(de)含菌(jun)(jun)(jun)(jun)粒(li)(li)子，在(zai)5分鐘(zhong)內沉(chen)(chen)降(jiang)(jiang) 距離為1.05cm，大(da)部分的(de)(de)(de)粒(li)(li)子就(jiu)沉(chen)(chen)降(jiang)(jiang)不(bu)到瓊脂表面上。

　　由于潔(jie)(jie)凈(jing)室已(yi)濾除了(le)大(da)部分(fen)大(da)顆粒(li)，一般用此(ci)法是無意義的。但(dan)是，人(ren)為(wei)、環境和潔(jie)(jie)凈(jing)裝(zhuang)置(zhi) 故障等原因引(yin)起的較大(da)顆粒(li)污染以及沉降平(ping)板采樣潔(jie)(jie)的簡便，可作為(wei)日常監測潔(jie)(jie)凈(jing)室水平(ping)的 一種參考方法。

　　3.5　關于RCS^［9］　離心式空(kong)氣(qi)采(cai)(cai)樣(yang)器(qi)(qi)（The Reuter Centrifugal Sampler,RCS）被(bei)介紹作為(wei)一種在(zai)醫院使用(yong)的(de)(de)檢 測空(kong)氣(qi)微(wei)生物的(de)(de)儀器(qi)(qi)，由于它輕(qing)便，無(wu)噪音而(er)廣泛(fan)使用(yong)，并擴(kuo)展到制(zhi)藥工業等(deng)領域。RCS通 過離心收(shou)集顆粒，為(wei)制(zhi)藥工業所接受，因(yin)為(wei)它似乎符(fu)合FDA所描述的(de)(de)“Active”采(cai)(cai)樣(yang)儀器(qi)(qi)。 。Gre-schel等(deng)認為(wei)它相當有效(xiao)，Macher等(deng)則持反對(dui)意見。多年來，許多研究者研究了帶菌 顆粒的(de)(de)大(da)小(xiao)，結論是(shi)：5-15μm，中等(deng)粒是(shi)13μm，而(er)4μm以下很少。這些結果是(shi)從(cong)醫院、手 術室(shi)、辦公室(shi)、實驗室(shi)和制(zhi)藥無(wu)菌室(shi)所獲得。他們認為(wei)，如果顆粒大(da)小(xiao)是(shi)已知的(de)(de)，RCS可定(ding)(ding) 量(liang)測定(ding)(ding)細菌濃(nong)度，但是(shi)，目前這些顆粒大(da)小(xiao)是(shi)未知的(de)(de)，故不(bu)能把它視為(wei)定(ding)(ding)量(liang)采(cai)(cai)樣(yang)器(qi)(qi)，只(zhi)能歸 于沉降平皿一樣(yang)的(de)(de)類型。Delmore等(deng)發現，100級無(wu)菌室(shi)中，RCS/slit比率(lv)是(shi)2.1，即RCS是(shi)s lit采(cai)(cai)樣(yang)器(qi)(qi)微(wei)生物捕促(cu)率(lv)的(de)(de)210%有效(xiao)。我國丁璽華等(deng)也仿制(zhi)了RCS，選用(yong)國產元件，試制(zhi)了LW C-1型離心式空(kong)氣(qi)采(cai)(cai)樣(yang)器(qi)(qi)。

　　雖(sui)然RCS有(you)正反兩方面的爭議，但(dan)由于(yu)它(ta)有(you)許多優點，并明顯優于(yu)沉降(jiang)平皿，1986年，西方 近一半的制(zhi)藥公(gong)司采用了RCS，作為空氣微(wei)生物(wu)采樣器，我(wo)國正在逐(zhu)漸推廣。